Diagnóstico ante-mortem de la tuberculosis bovina

El diagnóstico de base humoral de la TB permite detectar anticuerpos específicos frente a algunas de las proteínas micobacterianas más reactivas como ESAT-6, CFP-10, MPB83 o MPB70 (Bezos et al., 2014; Wiker, 2009). En esta línea, existe un gran interés por la P22, un complejo proteico altamente específico obtenido a partir de la inmunopurificación de la PPD bovina y que incluye las cuatro dianas anteriormente mencionadas (Infantes-Lorenzo et al., 2017). Este complejo ha sido testado experimentalmente en el diagnóstico humoral de TB tanto en bovino como en otros rumiantes domésticos (Infantes-Lorenzo et al., 2019) y otras especies animales domésticas y salvajes (Infantes-Lorenzo et al., 2019; Thomas et al., 2019). La principal ventaja de usar este complejo proteico en el diagnóstico humoral es su elevada especificidad, pudiendo reducir así las reacciones frente a algunas micobacterias no tuberculosas o micobacterias ambientales que pudieran interferir en el diagnóstico de la TB (Infantes-Lorenzo et al., 2017).

Como técnica, el diagnóstico humoral presentaría numerosas ventajas económicas y logísticas en el caso de poder utilizarse como alternativa a las pruebas oficiales en el futuro. A diferencia de la IDTB, el empleo de estas técnicas reduce las complicaciones asociadas al manejo de los animales al requerir ser manipulados tan solo en una ocasión, con la consiguiente disminución del estrés y mejora del bienestar animal. Por otro lado, al no necesitar de una estimulación antigénica como sí ocurre en la IDTB con la aplicación de las PPDs, la técnica podría repetirse sin necesidad de establecer plazos por la posible alteración de los resultados (Coad et al., 2010). También es destacable que, en explotaciones de difícil acceso o sin laboratorios cercanos, la detección de anticuerpos puede presentar ventajas con respecto a la prueba de IFN-γ ya que, a diferencia de ésta, las muestras no requieren de una estimulación antigénica previa a la técnica tras su recogida (Bezos et al., 2014). Finalmente, otra ventaja destacable que presentan estas técnicas es que algunos formatos como el ELISA admiten generalmente diferentes tipos de muestras como suero o plasma (Casal et al., 2017), leche (Buddle et al., 2013; Zhu et al., 2022) o incluso orina y saliva (Lyashchenko et al., 2021), permitiendo un análisis rápido y en un gran número de muestras de forma simultánea. En definitiva, los prometedores resultados de los trabajos de investigación y las ventajas expuestas anteriormente podrían anticipar la implementación de estas técnicas como método diagnóstico efectivo de la TB en determinadas situaciones epidemiológicas en un futuro próximo.

Plataformas experimentales para la detección de citoquinas

Las citoquinas son proteínas de bajo peso molecular implicadas en la regulación de la respuesta inmunitaria (Etna et al., 2014). Es necesario remarcar que las citoquinas pueden entenderse como señalizadores del estado inmunitario de un animal, del estado de infección o latencia de este, o de su respuesta frente a la vacunación, entre otros, de ahí el interés práctico por su estudio, detección y cuantificación. Aunque la detección de citoquinas específicas ya se emplea en la actualidad para el diagnóstico oficial en la prueba de IFN-γ (MAPA, 2023), las nuevas líneas de investigación se orientan hacia metodologías que mejoren a las técnicas actuales o que amplíen el abanico de citoquinas detectables para lograr un mejor rendimiento en términos de sensibilidad y especificidad (Smith et al., 2021; Steinbach et al., 2019).

Una de las técnicas experimentales empleadas en la detección de IFN-γ es el ELISpot, un ensayo de base inmunitaria que puede aplicarse para la detección de diferentes citoquinas en sangre previamente estimulada con antígenos específicos, de forma similar a la prueba de IFN-γ. La principal ventaja de este sistema es su gran sensibilidad, razón por la que se ha empleado de forma experimental para el diagnóstico de la TB, permitiendo incluso clasificar correctamente a los animales tuberculosos de forma más temprana que la prueba de IFN-γ, (Li et al., 2022).

Además del IFN-γ, existen otras citoquinas interesantes hacia las que se dirigen algunos estudios de investigación de la TB bovina en la actualidad, como la IL-2. Esta es una citoquina pro-inflamatoria secretada por los linfocitos en la respuesta inmune frente a las micobacterias (Whelan et al., 2011) y cuyo interés en la detección radica en que es considerada un importante biomarcador de infección, pero también de presencia de lesiones compatibles con TB, de una forma más específica incluso que el IFN-γ (Steinbach et al., 2019).

Ciertos estudios de investigación han tratado de implementar la detección de la IL-2 mediante diferentes técnicas en el laboratorio, incluyendo la citometría de flujo (Xia et al., 2020). En este estudio se pudo demostrar la relevancia de la IL-2 como biomarcador de TB determinando mediante citometría de flujo que existía una mayor producción de esta citoquina en animales con TB en comparación con aquellos que estaban sanos (Xia et al., 2020). Además, mediante esta metodología se pudo diferenciar entre animales infectados de TB y animales expuestos a micobacterias no tuberculosas (El-Naggar et al., 2015). Este último hallazgo podría tener gran utilidad práctica, ayudando a desarrollar metodologías para mitigar las interferencias diagnósticas que pueden provocar algunas micobacterias no tuberculosas en las pruebas diagnósticas oficiales contempladas en el programa de erradicación (Álvarez et al., 2008). Aunque estos hallazgos son muy interesantes y a día de hoy la citometría de flujo se emplea para diagnóstico en medicina humana (Clift, 2015), su aplicación en el diagnóstico rutinario a gran escala parece difícil en sanidad animal, debido especialmente al coste del equipamiento y la necesidad de un personal altamente especializado para su manejo (El-Naggar et al., 2015).

Empleo de bacteriófagos para el diagnóstico de la TB bovina

El empleo de bacteriófagos en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ya comenzó a finales del siglo pasado, por ejemplo, para el diagnóstico de la salmonelosis (Hirsh & Martin, 1983a, 1983b). El fundamento de este método comprende el uso de un virus bacteriano (bacteriófago) que infecta de forma específica a las micobacterias viables de una muestra, consiguiendo introducirse dentro de ellas. En este momento, el bacteriófago utiliza la maquinaria celular de la micobacteria para producir nuevas partículas víricas que se acumulan en el interior de esta hasta que consiguen salir al exterior para infectar nuevas micobacterias. La supervivencia del bacteriófago depende, por tanto, de la existencia previa de micobacterias vivas en la sangre o tejidos de los animales, lo cual podría emplearse como indicador de infección (Botsaris et al., 2016; Jones et al., 2020; Swift et al., 2020).

Algunas de las ventajas que presenta esta técnica radican en permitir un diagnóstico ante-mortem relativamente rápido (ya que tan solo se necesitarían entre 24 y 48 horas) pero también en la variedad de muestras que admitiría, como sangre, heces, saliva, tejidos, leche (y derivados), permitiendo un diagnóstico temprano y a diferentes niveles (Beinhauerova & Slana, 2021; Swift et al., 2013). Sin embargo, en estudios no publicados realizados en condiciones de campo se han obtenido sensibilidades más bajas de las inicialmente atribuidas a la técnica, posiblemente debidas al factor antes mencionado relativo a la poco probable presencia de micobacterias en sangre circulante de animales infectados.

La resonancia magnética nuclear y su aplicación en el diagnóstico de la TB bovina

Otra de las líneas experimentales seguidas en los últimos años con el objetivo de mejorar el diagnóstico de TB bovina ha sido la metabolómica, el estudio de unas sustancias de diferente naturaleza denominadas metabolitos, presentes en las células y los tejidos y que actúan a modo de marcadores de infección. Estos estudios novedosos emplean la resonancia magnética nuclear (RMN), gracias a la cual se detecta la presencia de estos metabolitos en fluidos biológicos de los animales (suero y plasma principalmente), de tal modo que se puedan elaborar patrones de presencia que permitan diferenciar entre animales infectados y sanos (Snowden et al., 2012). Recientemente, ciertos trabajos de investigación han evaluado esta técnica para el estudio de la TB bovina (Ruiz-Cabello et al., 2022), la TB en animales silvestres (Bauman et al., 2022) y la paratuberculosis (PTB) (De Buck et al., 2014).

En lo relativo a la TB bovina, aunque los estudios hasta la fecha han sido escasos, los resultados obtenidos han sido prometedores, diferenciando entre animales con TB y animales sanos con gran precisión en muestras de suero o plasma y sin requerir estimulación antigénica previa. Además, la RMN, al no tener base inmunológica y poder detectar un amplio abanico de metabolitos que se producen durante el transcurso de la TB (los cuales son modificables con base a diferentes criterios), sería potencialmente capaz de detectar animales en diferentes fases de la infección/enfermedad o aquellos animales tuberculosos con respuestas inmunitarias alteradas que no reaccionan a las pruebas diagnósticas oficiales(Ruiz-Cabello et al., 2022).

En conclusión, la comunidad científica se ha interesado por algunas de las metodologías de diagnóstico descritas en este artículo y que han surgido recientemente, y actualmente están trabajando para optimizarlas. Las plataformas que detectan simultáneamente múltiples citocinas parecen ser una de las formas más prometedoras de mejorar el rendimiento del diagnóstico porque contienen marcadores específicos expresados ​​en animales con infección latente que podrían no responder adecuadamente a las pruebas oficiales y propagar la infección de forma encubierta. Aunque muchas de las técnicas descritas tienen limitaciones técnicas y científicas, cosas que ahora no parecen posibles pueden serlo dentro de unos años debido a la velocidad a la que se desarrolla la tecnología.

Teniendo en cuenta la extensa investigación que se hizo para su optimización, técnicas oficiales como la detección de IFN-, que se desarrolló en 1990, tardaron 16 años en implementarse en España.