Hasta la fecha se han empleado diversos modelos de bovinos y ovinos gestantes para estudiar en profundidad las interacciones de Neospora caninum y Toxoplasma gondii con la placenta.
El uso de estos plantea una serie de desventajas éticas y económicas, por lo que distintos grupos de investigación han desarrollado modelos alternativos de cultivo celular basados en las dos principales poblaciones de la placenta: el trofoblasto y las células carunculares.
No obstante, el uso de estos modelos alternativos también plantea ciertas desventajas asociadas a la escasa representación de la población celular presente en la placenta en condiciones fisiológicas. Es por ello que distintos grupos han mostrado su interés por el desarrollo de modelos ex vivo, a medio camino entre los abordajes in vivo e in vitro.
MODELOS IN VIVO DE RUMIANTES
MODELOS DE INFECCIÓN NATURAL DE LA NEOSPOROSIS BOVINA
Las infecciones naturales son el único modelo disponible para estudiar la transmisión transplacentaria endógena de N. caninum.
En el ganado bovino naturalmente infectado, se ha relacionado el aumento de los niveles de anticuerpos específicos frente a N. caninum con una reactivación de la infección crónica durante la gestación61,62.
Siguiendo estos hallazgos, Rosbottom et al.63 determinaron las fluctuaciones mensuales de los anticuerpos durante la gestación en vacas infectadas de forma natural, a las que se practicó la eutanasia cuando se detectó la recrudescencia (a mitad de gestación)63.
 Este estudio demostró que todos los fetos estaban vivos en el momento de la eutanasia, pero el parásito ya había invadido la placenta y alcanzado los tejidos fetales cuando se detectó la recrudescencia. |
MODELOS DE INFECCIÓN NATURAL DE LA TOXOPLASMOSIS OVINA 
A diferencia de la neosporosis, la transmisión horizontal es la principal vía de infección por T. gondii en los pequeños rumiantes.
Los trabajos realizados con animales infectados de forma natural se han centrado en el estudio de las consecuencias de la infección, aportando poca información sobre las interacciones del parásito con la placenta. Las lesiones descritas en los abortos tras una infección natural son áreas multifocales de necrosis acompañadas de infiltrados inflamatorios no purulentos61.
MODELOS DE INFECCIÓN EXPERIMENTAL 
La mayor parte de nuestros conocimientos actuales sobre las interacciones parásito-placenta se derivan de las infecciones experimentales en animales y, afortunadamente, éstas pueden realizarse en las principales especies diana: el ganado bovino y ovino.
A pesar de que se ha trabajado ampliamente en el uso de modelos basados en roedores para el estudio de la neosporosis bovina, las diferencias en el tipo de placentación y la duración de la gestación impiden las extrapolaciones directas a los rumiantes. También se han demostrado marcadas diferencias entre los modelos ovino y murino para la toxoplasmosis64.
 Además, el ratón no es un hospedador natural de N. caninum73, lo que pone de manifiesto la relevancia de utilizar modelos de rumiantes para el estudio de estas enfermedades. |
La Figura 1 resume los principales modelos de rumiantes y los diseños experimentales utilizados para estudiar las interacciones de los parásitos con la placenta en ambas enfermedades.
Independientemente del momento y del parásito utilizado para la infección, se pueden definir tres tipos de modelos (Figura 1B):
1. Aquellos donde las muestras de placenta se recogen en el momento que se detectan las consecuencias de la infección (muerte fetal o aborto).
2. Otros donde las muestras de la placenta se obtienen en un momento fijo después de la infección, independientemente de la aparición de la muerte fetal o del aborto.
3. Los que realizan eutanasias en serie en distintos momentos tras la infección.
El éxito de estos modelos experimentales también depende de la selección de los animales adecuados.
Con el objetivo de minimizar variaciones individuales, deben seleccionarse animales:
Uniformes en cuanto a raza, peso y edad.
Deben ser preferentemente primíparos.
Deben estar libres de los principales agentes infecciosos reproductivos: N. caninum, Brucella abortus , virus de la diarrea vírica bovina (VDVB), Leptospira interrogans serovar Hardjo y virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina en el ganado vacuno; y N. caninum, T. gondii, virus de la enfermedad de la frontera, virus de Schmallenberg, Brucella spp., Coxiella burnetii y Chlamydia abortus en el caso del ganado ovino.
Con respecto a la neosporosis, en 2014 se publicó una revisión exhaustiva de los modelos de rumiantes utilizados46, en el que se destacó la necesidad de desarrollar un modelo normalizado de transmisión transplacentaria exógena que permita las comparaciones entre estudios.
Por ello, se realizaron varias infecciones experimentales con un mismo aislado (Nc-Spain7) en distintos momentos de la gestación bovina y bajo el mismo diseño experimental, lo que ha permitido comparar directamente los resultados53,76,78.
Los resultados concluyeron que una dosis de 107 taquizoítos administrada por vía intravenosa en la mitad de la gestación es adecuada para modelizar la patogenia de la neosporosis bovina debido a su alta tasa de aborto, infección de la placenta y transmisión vertical del parásito.
Del mismo modo, las infecciones experimentales con T. gondii se han llevado a cabo bajo diferentes diseños experimentales34, lo que impide realizar comparaciones directas e insta a desarrollar un modelo normalizado de transmisión horizontal.
Neosporosis bovina
Los modelos de primoinfección son el único enfoque experimental disponible para estudiar la neosporosis bovina, y sólo imitan la vía transplacentaria exógena.
El momento de la gestación en el que se realiza el desafío determina la aparición de la muerte fetal o la transmisión vertical del parásito, así como la gravedad de los cambios patológicos e inmunológicos en la placenta46.
Los resultados son bastante homogéneos, los placentomas procedentes de animales abortados tienen altas cargas parasitarias y graves y extensas lesiones.
Los animales infectados presentan una respuesta proinflamatoria exacerbada y también una alta expresión de citoquinas antiinflamatorias/reguladoras en la interfase materno-fetal76,77,87,88.
En general, todos los estudios realizados apoyan la hipótesis de que la infección al principio de la gestación desencadena una respuesta de tipo Th1 en la placenta que, junto con la replicación del parásito y la destrucción del tejido, puede contribuir a la muerte del feto. También se ha demostrado una asociación positiva entre el elevado número de linfocitos T en la placenta y la aparición del aborto89.
Mitad de gestación 
Las infecciones experimentales a mitad de gestación (110-140 días) pueden inducir lesiones en el feto, pero también el nacimiento de terneros infectados de manera congénita pero clínicamente sanos.
Se ha sugerido que este modelo puede ser útil para entender por qué algunas vacas abortan y otras no.
En infecciones a mitad de la gestación el parásito se detecta en la placenta a los 10 dpi (días post infección)50, y la muerte fetal a partir de los 20 dpi en adelante50,74,85,91.
La supervivencia fetal se asocia con la mayor expresión de citoquinas Th1, Th2 y Treg, y una regulación negativa del TGF-β en placentomas. Por el contrario, la respuesta inmunitaria en los casos de muerte fetal se caracteriza por la regulación negativa de las citoquinas Th2 y Treg88 y la mayor expresión de factores como IL-8, iNOS y TNF-α15.
Final de la gestación 
Las consecuencias de la infección experimental al final de gestación son menos graves en la interfaz materno-fetal, lo que explicaría el resultado clínico tras la infección, caracterizado principalmente por el nacimiento de animales sanos pero congénitamente infectados.
En los placentomas obtenidos de animales sacrificados a los 21 dpi, N. caninum fue detectado esporádicamente, encontrándose lesiones muy leves y una expresión modesta de citoquinas Th1 y Th2.
Este modelo es útil para comprender las bases de la transmisión transplacentaria y la supervivencia fetal.
Recientemente, se ha utilizado un modelo de eutanasia en serie para estudiar los eventos iniciales de la infección (10 y 20 dpi) en vacas infectadas a mitad de la gestación53.
| Este estudio demostró que la activación temprana de la respuesta inmunitaria innata es crucial para el control adecuado de N. caninum en la placenta, mientras que una respuesta inmunitaria proinflamatoria exacerbada puede llevar a un daño tisular grave, con una profunda alteración en la organización de la matriz extracelular (MEC), ocasionando la muerte del feto. |
Toxoplasmosis ovina
Independientemente del periodo de gestación en el que se realiza el desafío (Figura 1), la mayoría de las infecciones experimentales documentadas hasta el momento han prolongado la duración de los experimentos hasta la aparición del aborto, generalmente alrededor de los 30 dpi.
Estos estudios describen un daño extenso de la placenta causado por la replicación del parásito, con lesiones similares a las descritas en infecciones naturales34,44,100.
En estos abortos se observaron restos parasitarios en la carúncula materna, mientras que se encontraron vacuolas parasitarias en los trofoblastos del cotiledón fetal, lo que sugiere que los parásitos se reconocen primero en la parte materna de la placenta, donde estimulan la respuesta inmunitaria materna, y luego se propagan al feto a través de las vellosidades del trofoblasto fetal, donde permanecen viables69.
Frente al conocido aborto “clásico”, que ocurre a partir de los 30 dpi, también se han descrito abortos tempranos que ocurren durante la fase aguda de la infección y se caracterizan por aparecer entre los 8-11 dpi y por la ausencia del parásito en placenta y feto44,64,82,101,102.
Actualmente, los abortos tempranos se han convertido en la presentación clínica predominante de la toxoplasmosis experimental. Concretamente, la infección con 2.000 y 500 ooquistes esporulados da lugar a casi un 100% de abortos tempranos.
Por lo tanto, el desarrollo de un modelo capaz de reproducir los abortos en fases más tardías descritos en las infecciones naturales es una necesidad urgente.
Varios estudios han investigado la dinámica de la infección por T. gondii mediante modelos de eutanasia en serie44,47.
T. gondii se ha detectado en la placenta a partir de los 10-12 dpi; los porcentajes de detección y las cargas de parásitos fueron mayores a medida que avanzaba la infección.
Al igual que en el caso de la neosporosis bovina, el momento de la gestación en el que se produce la infección también influye en la gravedad de la lesión, la distribución del parásito y la expresión de citoquinas en la placenta, pero muy pocos estudios han abordado estas cuestiones. Asimismo, tampoco se han descrito los mecanismos que subyacen a los abortos tempranos.
La infección a mitad de gestación resulta en lesiones más graves y mayor carga parasitaria, tanto en la placenta materna como en la fetal. Sin embargo, la colonización de la placenta por el parásito y el desarrollo de lesiones tiene lugar de forma más temprana en infecciones más tardías41,44.
Mientras que las citoquinas proinflamatorias aumentaron igualmente en las infecciones en los tres períodos de gestación, la IL-4 aumentó principalmente en el primero y segundo, y la IL-10 en el último período16.
Este desequilibrio en las respuestas Th1 y Th2 podría desempeñar un papel clave en la patogenia de la toxoplasmosis, pero este tema sigue siendo controvertido en la comunidad científica.
MODELOS IN VITRO DE RUMIANTES
En los últimos años se han desarrollado y utilizado ampliamente varios modelos de placenta humana in vitro para estudios en diferentes parásitos de animales y humanos104, y se han realizado esfuerzos similares para obtener líneas celulares primarias y establecidas de la placenta bovina y ovina (Tabla 1).
A pesar de que el número disponible de estas líneas celulares es considerable, la mayoría de ellas no son adecuadas para realizar estudios sobre las interacciones parásito-hospedador, ya que suelen estar contaminadas con Mycoplasma spp. y VDVB.
Para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados, es primordial seleccionar las líneas celulares adecuadas.
En este sentido, las líneas celulares BCEC- 1 y F3, ambas derivadas de carúncula y trofoblasto bovino, respectivamente, se han utilizado con éxito para realizar infecciones in vitro con N. caninum.
El uso de ambas líneas celulares ha contribuido a esclarecer varios aspectos de las interacciones hospedador-parásito en la neosporosis.
En 2006 se originó la línea celular AH-1 a partir de la placenta ovina para realizar infecciones in vitro con taquizoítos de N. caninum127.
En cuanto a T. gondii, y teniendo en cuenta su naturaleza zoonósica, se han realizado muchos estudios in vitro utilizando líneas celulares de placenta humana.
No obstante, el uso de modelos in vitro se ve limitado principalmente por:
La falta de estimulación y actividad de las células inmunitarias residentes o atraídas a la placenta.
La falta de los mecanismos del hospedador para compensar las condiciones de estrés.
La ausencia de la matriz extracelular (MEC), implicada en la patogenia de algunas enfermedades, incluida la toxoplasmosis16,58,59.
MODELOS EX VIVO DE RUMIANTES
El término explante se refiere a una porción de un tejido u órgano vivo que, una vez extraído de un animal y transferido a condiciones de cultivo artificial, es capaz de mantener sus funciones durante un breve período de tiempo, lo que permite realizar experimentos controlados sobre él.
| Durante los últimos 80 años se han publicado numerosos trabajos sobre el uso de explantes de placenta para la investigación en medicina humana, lo que contrasta con los escasos trabajos realizados con explantes de placenta de rumiantes. |
Hasta la fecha no se ha descrito el uso de explantes placentarios para estudiar el efecto de N. caninum y T. gondii en rumiantes.
Sin embargo, la literatura disponible apoya su empleo como un enfoque valioso capaz de diseccionar los mecanismos patogénicos y la respuesta del hospedador desencadenada tras la infección, superando así las limitaciones de los cultivos in vitro.
Los recientes esfuerzos han dado lugar al desarrollo de un modelo ex vivo basado en secciones de placentomas de vaca169.
Este modelo se ha aplicado para describir el efecto de los disruptores endocrinos ambientales en la placenta bovina170.
De mayor interés es su uso para ampliar lo que se conoce sobre la patogenia de la placentitis y el aborto inducidos por B. abortus.
Se han seguido enfoques similares para estudiar la patogenia de Listeria monocytogenes y Listeria ivanovii, también responsables de abortos y fallos reproductivos en el ganado.
En cuanto a los modelos ex vivo ovinos, cabe mencionar un trabajo reciente en el que se comparó el efecto de la infección ex vivo con Trypanosoma cruzi y T. gondii entre tres barreras placentarias diferentes: humana, canina y ovina.
Este estudio demostró que la carga parasitaria parecía ser independiente de la complejidad de la placenta. Además, ésta era siempre mayor en los explantes infectados por T. gondii, donde el daño tisular tendía a ser más grave176.
En resumen, el desarrollo de modelos ex vivo para la placenta bovina y ovina abre nuevas perspectivas para estudiar en profundidad la intrincada relación entre estos dos parásitos apicomplejos y sus hospedadores durante la gestación.
EXPLANTES PLACENTARIOS: ventajas y desventajas
Estos modelos mantienen la arquitectura del tejido y la MEC entre todos los tipos de células que conforman la placenta, reproduciendo así las condiciones fisiológicas in vivo mejor que los sistemas in vitro178.
Las células pueden mantener el contacto físico con la lámina basal, lo que permite la recepción de señales paracrinas de las capas subyacentes. Además, la presencia de células inmunitarias permite el estudio de procesos únicos de inmunomodulación que podrían ser imperceptibles mediante enfoques in vivo e indetectables in vitro.
Los explantes podrían constituir una herramienta excelente para estudiar las infecciones parasitarias y los mecanismos antiparasitarios locales179.
Otras ventajas serían la mayor cantidad de variables que se pueden probar en un solo experimento, los tiempos experimentales más cortos y una menor variabilidad individual entre experimentos.
Además, los explantes podrían aislarse de placentas a diferentes términos para investigar el impacto de la edad gestacional en un determinado parámetro148,177.
Desde el punto de vista ético, la utilización de modelos ex vivo cumpliría el principio de las “Tres R” (Reemplazo, Reducción, Refinamiento).
A pesar de todo lo anterior, la utilización de enfoques ex vivo de la placenta no está exenta de algunas desventajas:
Vida útil de los explantes corta, ya que sólo pueden utilizarse justo después de la recogida del tejido.
Escasa disponibilidad de tejidos adecuados para la obtención de explantes.
No obstante, los explantes placentarios podrían someterse a métodos de criopreservación que permitieran su obtención de forma estandarizada de animales seleccionados, reduciendo así la variabilidad entre experimentos, y su utilización bajo demanda104. Actualmente, se dispone de varios métodos exitosos para congelar placentas humanas y caninas.
 En consecuencia, parece factible el desarrollo de protocolos de criopreservación de explantes placentarios en especies de rumiantes y su posterior utilización para el estudio de enfermedades que causan fallos reproductivos. |
CONCLUSIONES FINALES
Los modelos in vivo son indiscutiblemente las mejores herramientas disponibles para obtener información fiable sobre los mecanismos responsables del fallo reproductivo ocasionado por N. caninum y T. gondii.
Deben desarrollarse modelos estandarizados para cada enfermedad, o al menos, utilizar diseños experimentales previamente descritos para permitir la comparación directa entre trabajos.
Sin embargo, el uso de modelos in vivo incurre en costes más elevados, periodos experimentales más largos y limitaciones éticas, lo que hace necesario el uso de modelos alternativos.
Los modelos in vitro han demostrado ser útiles para describir el comportamiento de N. caninum tras la infección, pero aún queda mucho trabajo por hacer para T. gondii.
La selección de líneas celulares adecuadas es primordial para garantizar resultados fiables y reproducibles.
Otras alternativas, como los explantes de placenta, tienen el potencial de superar las limitaciones de los modelos in vitro, pero su aplicación será limitada hasta que se hayan desarrollado métodos de criopreservación adecuados.
Adaptado y traducido del artículo original: “Modeling the ruminant placenta-pathogen interactions in apicomplexan parasites: current and future perspectives”, Pastor-Fernández I, Collantes-Fernández E, Jiménez-Pelayo L, Ortega-Mora LM and Horcajo P (2021); Front. Vet. Sci. 7:634458. doi: 10.3389/ fvets.2020.634458
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