Las infecciones intramamarias subclínicas asociadas a Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus suponen un importante problema en los rebaños de vacuno lechero, ya que ocasionan una reducción de la calidad y la cantidad de leche y tienen importantes repercusiones económicas, diagnósticas y sobre la salud pública.
El control de la mamitis bovina ocasionada por Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus depende, en gran medida, de la prevención de nuevas infecciones dentro y entre los rebaños mediante unas correctas medidas de bioseguridad, siendo importante tener en cuenta que la transmisión de estos patógenos se produce principalmente durante el ordeño.
Las prácticas de higiene durante el ordeño y la limpieza del pezón en los sistemas de ordeño automatizados difieren sistemas de ordeño convencionales, con un mayor número de vacas por unidad de ordeño y sin contacto con las manos del personal.
Existen diferencias en la prevalencia de Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus aislados a partir de la leche y de la piel del pezón al comparar el sistema automatizado y el convencional.
Ambas bacterias son reconocidas como patógenos contagiosos causantes de mastitis, siendo importante tener en cuenta la existencia de reservorios ambientales.
Así, a pesar de que Streptococcus agalactiae se había considerado como un patógeno intramamario, se ha aislado a partir de la piel del pezón y otras zonas de la vaca (recto y vagina) y de la nave (bebederos, robots de ordeño y cubículos).
El ciclo de transmisión fecal-oral podría perpetuar y amplificar la presencia de Streptococcus agalactiae en los rebaños lecheros.
Esto, unido al hecho de la existencia de reservorios ambientales de estos patógenos, podría explicar por qué Staphylococcus aureus sigue siendo un problema y por qué ha habido una reemergencia de Streptococcus agalactiae coincidiendo con el incremento del número de granjas que emplean sistemas de ordeño automatizado.
Patrones de colonización de la ubre
La piel del pezón de las vacas podría ser un importante reservorio de patógenos contagiosos causantes de mastitis, ya que la presencia de bacterias en esta superficie se asocia a infecciones intramamarias subclínicas en el mismo cuarterón.
Asimismo, también se han aislado estas bacterias en cuarterones sin infección subclínica, lo que implica que la colonización y/o contaminación de la piel del pezón a partir de fuentes distintas a la leche del mismo cuarterón es muy posible.
Para conocer más a fondo los patrones de colonización de la ubre, se tomaron muestras de leche y de la superficie cutánea del pezón de 1.142 cuarterones de 300 vacas con mastitis subclínica en 8 rebaños positivos a Streptococcus agalactiae, detectándose:
- Staphylococcus aureus en el 8,1% de las muestras de leche y en el 6,6% de las muestras cutáneas, con un 1,3% de los cuarterones positivos, tanto para las muestras de leche como las de piel.
- Streptococcus agalactiae en el 7,4% de las muestras de leche y en el 0,35% de las muestras cutáneas, con un 0,26% de los cuarterones positivos, tanto para las muestras de leche como las de piel.
El control de Staphylococcus aureus y, especialmente, el de Streptococcus agalactiae en las granjas lecheras de gran tamaño sin tomar en consideración los reservorios ambientales podría suponer el fracaso de la estrategia de control y erradicación.
El reto del diagnóstico precoz
La monitorización del estatus sanitario de la ubre es imposible si no se cuenta con métodos de diagnóstico fiables y asequibles.
Por ello, las pruebas de diagnóstico precoz específicas de patógenos relacionados con la mastitis subclínica son cruciales para poder instaurar el tratamiento adecuado o separar a los animales infectados, pudiendo así adoptar medidas para reducir el riego de nuevas infecciones dentro del rebaño, así como su transmisión a otros.
Entre las técnicas disponibles actualmente para la detección precoz de las mastitis, destaca el cultivo microbiológico, la PCR y, más recientemente, la técnica MALDI-TOF. ¿En qué consisten estas técnicas y qué información nos pueden proporcionar sobre la salud de la ubre?
Hasta ahora, el cultivo microbiológico ha sido el “Gold Standard” para la identificación de patógenos relacionados con la mastitis, pero la PCR está ganando cada vez más protagonismo en la monitorización de la salud de la ubre.
La PCR se caracteriza por su alta sensibilidad, sus rápidos resultados y su capacidad para detectar un rango más amplio de patógenos de forma simultánea.
La PCR también puede ofrecer falsos positivos, con la detección de patógenos que no estén relacionados con la infección y que puedan conducir a un diagnóstico erróneo
En el cultivo microbiológico sólo se detectan bacterias viables, pero en caso de infección la presencia de un cultivo puro es muy informativa. Esto hace que se pueda considerar como un método más específico en determinados casos.
Por otro lado, la PCR detecta también bacterias muertas y puede ser útil en casos en los que la viabilidad bacteriana no pueda garantizarse en la muestra o se haya realizado algún proceso que destruya las bacterias, como una desinfección.
Por lo tanto, ambos métodos ofrecen información útil sobre distintos aspectos de los patógenos presentes en la ubre y en el entorno.
El análisis por PCR de las muestras tomadas de la piel del pezón o del entorno podría ser una herramienta muy útil para el control de las mastitis asociadas a Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus.
Para poder determinar el valor diagnóstico de la PCR, se llevó a cabo un estudio estimando la sensibilidad y especificidad de un test comercial de qPCR en comparación con el cultivo bacteriano para la identificación de Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus en muestras de leche y de piel del pezón de vacas con un elevado RCS (Recuento de Células Somáticas) de rebaños con un sistema de ordeño automatizado.
1.Se seleccionaron aleatoriamente 30-40 vacas con un alto RCS de ocho granjas lecheras danesas positivas a Streptococcus agalactiae, tomando las muestras cutáneas y de leche en condiciones asépticas a partir del cuarterón trasero derecho.
2.Se aislaron las colonias bacterianas de Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus, realizando una identificación fenotípica basada en características morfológicas.
3.Además, las muestras fueron analizadas mediante un kit comercial de qPCR, estimándose su sensibilidad y especificidad.
Se concluyó que la sensibilidad para el diagnóstico de Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus es mayor para la qPCR que para el aislamiento bacteriano, lo que sugiere que la qPCR es un método valioso para la detección de ambos patógenos a nivel de cuarterón a partir de muestras de leche.
Por otro lado, en muestras de la superficie cutánea del pezón, también se confirmó que la eficacia del aislamiento de Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus en muestras de la superficie cutánea del pezón es peor que la de la qPCR, lo que implica que es importante tomar en consideración las diferencias en las condiciones de ambos métodos a la hora de implementarlos en la detección rutinaria de colonizadores de la piel del pezón.
MALDI-TOF
Una técnica prometedora para la identificación de patógenos asociados a mastitis en vacuno lechero es la técnica MALDI-TOF (Desorción/Ionización mediante Láser Asistida por Matriz con Detección de Masas por tiempo de vuelo), una herramienta de diagnóstico capaz de identificar una amplia variedad de bacterias.
También permite la identificación y diferenciación de estafilococos no aureus (NAS) en muestras tomadas de vacas con mastitis, aunque requiere de pruebas adicionales para poder tener un diagnóstico definitivo.
La técnica MALDI-TOF se basa en el empleo de un láser para lograr la excitación de las proteínas contenidas en la muestra, creando así un patrón de proteínas específica del microorganismo.
La “huella proteica” de un determinado microorganismo aislado en la muestra se compara con miles de patrones, pudiendo identificar de forma precisa al agente implicado.
Esta técnica ofrece una nueva plataforma de diagnóstico que permite superar las limitaciones de las técnicas tradicionales que son laboriosas y requieren tiempo.
La técnica MALDI-TOF ha demostrado ser eficaz en la identificación de NAS en muestras de leche, pero no se había comprobado su eficacia en otros tipos de muestras.
Para dilucidar esta cuestión, se tomaron muestras de leche y de la superficie del pezón de vacas con elevado RCS, realizándose una identificación de las colonias bacterianas de los cultivos sospechosos de tener NAS mediante la técnica MALDI-TOF.
Del total de 511 aislados que se seleccionaron como NAS en los cultivos, se logró identificar el 78% mediante MALDI-TOF:
- El porcentaje de NAS identificados correctamente en leche (91%) fue superior al porcentaje identificado en la piel del pezón (68%).
- La técnica MALDI-TOF identificó correctamente los aislados en la primera prueba en el 85% (muestras de leche) y 62% (piel del pezón).
- De todas las bacterias identificadas, el 93% se identificó como NAS.
- De las bacterias NAS identificadas incorrectamente en los cultivos, solamente una procedía de la muestra de leche, mientras que las restantes procedían de la piel del pezón (Aerococcus viridans, Bacillus pumilus, Enterococcus saccharolyticus, Clostridium septicum, Corynebacterium stationis y Corynebacterium casei).
Esta incongruencia entre el cultivo y el MALDI-TOF se podría explicar por la mala identificación en el cultivo como NAS o por la ausencia de estas bacterias NAS en la base de datos que usa el MALDI-TOF.
También se observó que, en el caso de las muestras cutáneas del pezón, eran necesarias más rondas de identificación. Esto podría deberse a que los aislados bacterianos, al encontrarse expuestos al entorno, pudieran haber desarrollado una capa adicional o una cápsula como protección frente a las condiciones ambientales desfavorables.
Los resultados de este estudio revelan que la técnica MALDI-TOF es una herramienta válida para la identificación y tipificación de especies NAS a partir de muestras de leche, pero es menos efectiva en el caso de aislados procedentes de la piel del pezón.
Se puede concluir que la técnica MALDITOF es fiable para la identificación y diferenciación de especies NAS, aunque es necesario contar con herramientas basadas en la detección de ácidos nucleicos para poder confirmar la identificación de determinadas especies y cepas.
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