La diarrea neonatal es la principal patología y la primera causa de mortalidad en terneros de primeras edades.
La aparición y gravedad de esta clínica digestiva depende de diversos factores desencadenantes:
Agentes infecciosos que pueden ser de naturaleza vírica, bacteriana o parasitaria, y con frecuencia actúan de manera simultánea.
Factores ambientales, como temperatura y humedad.
Factores asociados al manejo, como una deficiente higiene y un mal encalostramiento.
 Rotavirus A (RVA) es el agente viral más prevalente en las diarreas neonatales, cursando con un cuadro grave de diarrea y deshidratación en los animales, principalmente en la primera semana de vida. |
La diarrea es de tipo acuoso y coloración amarillenta-grisácea o parda y en ocasiones presenta sangre y/o moco. La morbilidad es muy elevada, pudiendo llegar al 80% y la letalidad al 20%.
Debido a la prevalencia y al cuadro clínico que ocasiona el RVA, es esencial instaurar medidas preventivas para disminuir la probabilidad de aparición de un brote.
Considerando la gran diversidad descrita para este agente, la caracterización de la cepa del RVA circulante en las explotaciones afectadas puede proporcionar información relevante para mejorar las medidas de control adoptadas2.
ROTAVIRUS A – UN PATÓGENO MUY DIVERSO
Los rotavirus son virus ARN de doble cadena y con un genoma segmentado (11 segmentos), característica que, al igual que a otros patógenos como la Influenza A, les confiere una gran ventaja evolutiva.
Durante su replicación, si dos cepas diferentes del RVA coinfectan la misma célula, puede ocurrir el reordenamiento genético (reassorment) en el que la progenie viral contiene combinaciones de los diferentes genes parentales.
Este proceso, junto con otros mecanismos evolutivos como las mutaciones puntuales o los rearreglos genéticos (inserciones y/o deleciones), son la principal causa de la gran diversidad genética observada en estos virus.
Aunque un total de 9 especies de rotavirus han sido descritas hasta el momento (A – J), el Rotavirus A sigue siendo la principal causa de problemas entéricos en animales domésticos, incluido el ganado bovino.
En los últimos años, varios estudios han evaluado la diversidad del RVA, llegando a establecerse un sistema de clasificación binario basado en la caracterización de dos proteínas de la cápside (VP4 y VP7) que guardan relación directa con la inmunidad protectora frente a este agente.
| Con este sistema el RVA puede ser clasificado:
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Aunque se han descrito hasta la fecha 27 tipos G y 35 tipos P diferentes en animales y humanos, en bovino solo se han reportado 12 tipos G y 11 tipos P, siendo los más prevalentes:
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Según su VP4 en tipo P (proteasa sensitiva)
Según su VP7 en tipo G (glicoproteína)
La caracterización de un agente patógeno en las poblaciones afectadas y en condiciones de campo proporciona una información valiosa para entender mejor la epidemiología de dicha enfermedad.
| En nuestro caso, caracterizar al RVA presente en una explotación permite discernir si la cepa circulante es similar o diferente a la de brotes ocurridos previamente en dicha granja o en explotaciones relacionadas, ayudando así a mejorar o corregir las medidas instauradas para el control de esta enfermedad.
Por otro lado, ampliar los conocimientos sobre la diversidad del RVA en cada una de las especies animales susceptibles es esencial también para el desarrollo de mejores estrategias de inmunización. |
CARACTERIZACIÓN DEL ROTAVIRUS A
Varias herramientas pueden ser utilizadas para caracterizar un agente y, entre ellas, la secuenciación de genes específicos es la más habitual. Esta técnica permite conocer la secuencia concreta de los nucleótidos que componen un gen y ha servido para caracterizar un buen número de patógenos en el ámbito veterinario.
En el caso del RVA, la secuenciación de los genes codificantes para la VP4 y la VP7 es el método más usado para su caracterización.
El genotipado del RVA se realiza tras su identificación en la muestra y, para este fin, la PCR en tiempo real (qPCR) con resultados cuantitativos es lo más recomendado. Esto es importante, pues se ha observado que una baja carga viral, junto con la presencia de coinfecciones, son factores que afectan negativamente al resultado de la secuenciación.
Genotipado por secuenciación
El proceso de genotipado de RVA (Figura 1) se inicia con la amplificación de los genes codificantes para la VP4 y VP7 mediante PCR convencional, sobre el ARN extraído de la muestra y siguiendo unos protocolos previamente validados.
Los productos amplificados son posteriormente secuenciados, usando los mismos cebadores de la PCR convencional, mediante la metodología de Sanger y con equipos específicos que incorporan técnicas fluorescentes y electroforesis capilar.
Tras una normalización de los resultados con el software de dichos equipos, la información de las secuencias obtenidas queda recogida en unos archivos FASTA para su posterior evaluación mediante herramientas bioinformáticas.
La asignación del genotipo P y G específico de la cepa de RVA en estudio se realiza mediante el análisis de las secuencias de VP4 y VP7, respectivamente, y usando varias herramientas bioinformáticas como el BLASTn en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) o el RotaC en la base de datos del ViPR (Virus Pathogen Resource).
Filogenia y homología nucleotídica
Adicionalmente, las secuencias nucleotídicas de ambos genes pueden ser analizadas para la elaboración de dendogramas o árboles filogenéticos, que representan las relaciones evolutivas entre un grupo de organismos relacionados. Estos árboles se pueden representar gráficamente de distintas formas, aunque la más común es aquella en la que se parte de un único nodo como ancestro común.
El uso de árboles filogenéticos:
Puede ayudar a interpretar las relaciones de parentesco entre cepas circulantes, identificadas incluso en distintos momentos, en una o más explotaciones afectadas.
El análisis de la homología nucleotídica:
Permite comparar las secuencias (VP4 y VP7) de distintos casos de RVA con la finalidad de obtener el grado de similitud entre ellas.
El porcentaje de similitud entre estas secuencias permite valorar, por ejemplo, si dos brotes en una misma granja o en granjas distintas están causados por una misma cepa viral.
DIVERSIDAD GENÉTICA DEL RVA EN ESPAÑA
A pesar de la relevancia de la industria bovina en nuestro país, poco se ha investigado sobre la diversidad del RVA en nuestra ganadería.
Recientemente, un estudio preliminar realizado por Exopol y un grupo de investigación de la Universidad de Zaragoza, ha descrito los primeros hallazgos sobre la ocurrencia y diversidad genética del RVA en casos de terneros con diarrea neonatal en España1.
El estudio evaluó un total de 237 muestras digestivas de animales con diarrea neonatal recibidas en nuestro laboratorio durante el periodo 2017- 2018 y procedentes de 29 provincias españolas.
Genotipado por secuenciación
La presencia de RVA fue identificada por qPCR en el 51% de estas muestras, aunque por lo general en coinfección con otros enteropatógenos como Cryptosporidium parvum y Coronavirus bovino.
El genotipado de RVA se realizó en 26 casos positivos procedentes de granjas diferentes en 12 provincias.
Aunque fue posible identificar el genotipo en la mayoría de las muestras, en cinco de ellas (una VP7 y cuatro VP4) no se pudo obtener un producto de amplificación, por lo que fueron consideradas como no tipables.
Tres tipos G y dos tipos P diferentes fueron identificados en los animales del estudio.
Entre los genotipos G, el G6 (n=20) fue el más frecuente, seguido del G10 (n=4) y el G3 (n=1).
En el caso de los genotipos P, once de las muestras fueron identificadas como genotipos P[5] y otras once como genotipo P[11].
Estos resultados se corresponden con otras investigaciones realizadas en diversos países que señalan que el G6 es el tipo G más frecuente en el bovino (57%), mientras que el P[5] con un 26% lo es en los tipos P1,5.
No obstante, aunque la combinación más prevalente de RVA fue la G6P[5], otros cuatro tipos de combinaciones también fueron identificadas en los casos clínicos del estudio (Tabla 1).
La combinación G6P[5] ha sido descrita también como la más común en otros países europeos como Francia, Alemania e Irlanda3,4,5, mientras que la G6P[11] lo es en Italia y Turquía5,6.
Filogenia y homología nucleotídica
Genotipo G
El análisis filogenético de las secuencias de los casos con genotipo G6 mostraba que la mayoría de cepas (78%) del estudio se agrupaban en un mismo clúster, incluidas dos secuencias de cepas vacunales usadas en nuestro sector (Figura 2).
Sin embargo, otros cuatro casos con genotipo G6 formaban subgrupos separados y mostraban una homología nucleotídica menor al 86% con las otras cepas, lo que demuestra la gran variabilidad existente dentro de este genotipo.
Genotipo P
Al evaluar la homología nucleotídica para las secuencias con genotipo P, se observó que la identidad fue mayor al 90% para las tipo P[5], incluida la secuencia de una de las vacunas comerciales, pero menor al 70% con la secuencia tipo P[1] presente en la otra vacuna (Figura 3).
En el caso de las cepas P[11] la identidad fue mayor al 95%, siendo interesante resaltar que ninguna de las vacunas disponibles contenía este genotipo.
| Los resultados de este estudio demuestran la gran diversidad genética que tiene el RVA en las granjas evaluadas y resalta la importancia del genotipado para conocer mejor su epidemiología.
El uso de estas herramientas será de gran utilidad para:
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BIBLIOGRAFÍA
1. Benito, A.A., Monteagudo, L.V., Arnal, J.L., Baselga, C., Quílez, J., 2020. Occurrence and genetic diversity of rotavirus A in faeces of diarrheic calves submitted to a veterinary laboratory in Spain. Prev. Vet. Med. 185, 105196.
2. Cho, Y., Yoon, K., 2014. An overview of calf diarrhea-infectious etiology, diagnosis, and intervention. J. Vet. Sci. 15, 1–17.
3. Collins, P.J., Mulherin, E., Cashman, O., Lennon, G., Gunn, L., O’Shea, H., Fanning, S., 2014. Detection and characterisation of bovine rotavirus in Ireland from 2006–2008. Ir. Vet. J. 67, 13.
4. Kaplon, J., Fremy, C., Bernard, S., Rehby, L., Aho, S., Pothier, P., Amert-Balay, K., 2013. Impact of rotavirus vaccine on rotavirus genotypes and caliciviruses circulating in French cattle. Vaccine 31, 2433–2440.
5. Papp, H., L´aszl´o, B., Jakab, F., Ganesh, B., De Grazia, S., Matthijnssens, J., Ciarlet, M., Martella, V., B´anyai, K., 2013. Review of group A rotavirus strains reported in swine and cattle. Vet. Microbiol. 165, 190–199.
6. Monini, M., Cappuccini, F., Battista, P., Falcone, E., Lavazza, A., Ruggeri, F.M., 2008. Molecular characterization of bovine rotavirus strains circulating in northern Italy, 2003–2005. Vet. Microbiol. 129, 384–389.
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