Detección de bacterias productoras de tuberculosis bovina en tejidos mediante PCR directa
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica, debilitante y zoonósica producida por distintas especies de micobacterias pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) y que afecta a multitud de especies de mamíferos, incluyendo al ganado bovino.
La aparición de sintomatología, principalmente respiratoria, y de lesiones granulomatosas compatibles con tuberculosis se ha visto reducida significativamente en ganado bovino en las últimas décadas en España y en otros países desarrollados gracias a la implantación de los programas de erradicación.
Estos programas, basados en el diagnóstico de los animales infectados y su sacrificio, aunque suponen un gran esfuerzo económico para los ganaderos y las administraciones involucradas, han permitido la eliminación de esta enfermedad infecciosa en el 97,72% de los rebaños en España en 2018.
DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS BOVINA
Las técnicas oficiales de diagnóstico de la tuberculosis bovina están recogidas en la legislación comunitaria (Directiva Comunitaria 64/432/EEC) y nacional (RD 1716/2000), y quedan patentes también en el programa nacional de erradicación de la tuberculosis bovina (MAPA, 2019).
Está definido que las pruebas antemortem oficiales son:
- La prueba de la intradermotuberculinización.
- La detección de gamma-interferon en sangre.
Los animales con un resultado positivo a estas pruebas son sacrificados y, junto con aquellos animales en los que se detectan lesiones compatibles con tuberculosis durante la inspección rutinaria de las canales en un matadero, se recogen muestras para la realización de un cultivo microbiológico para el aislamiento del agente etiológico.
Los tejidos de elección para el cultivo microbiológico y diagnóstico de tuberculosis están recogidos en el Manual de Procedimiento para la toma y envío de muestras, siendo principalmente linfonodos aunque, en el caso de presentarse lesiones compatibles, pueden obtenerse también de órganos parenquimatosos como el hígado o los pulmones (MAPA & VISAVET, 2017).
Figura 1. Esquema de trabajo para la identificación del agente etiológico de la tuberculosis en animales. El diagnóstico oficial incluye el cultivo microbiológico y la identificación del agente etiológico mediante técnicas moleculares (PCR). La detección del CMTB puede realizarse directamente en los tejidos mediante una extracción de ADN seguido de una PCR a Tiempo Real.
CULTIVO MICROBIÓGICO
El cultivo microbiologico requiere seguir una serie de pautas:
- Con el fin de recuperar las bacterias viables del tejido muestreado, éste se somete a un proceso de homogeneización física mediante el cual se disgrega la estructura tisular.
- Para evitar el crecimiento de otros microorganismos que también pueden estar presentes en la muestra y aprovechando la resistente pared celular de las micobacterias, los homogeneizados son descontaminados con un agente químico, como por ejemplo el cloruro de hexadecilpiridinio.
- Una vez que los tejidos están descontaminados, una parte de la muestra es inoculada sobre medios de cultivo específicos para el crecimiento de micobacterias del CMTB.
Las plataformas de cultivo de micobacterias pueden dividirse en:
- Sólidas, entre las que se encuentran los medios Löwenstein- Jensen o Coletsos.
- Líquidas, entre las que destaca el sistema BD BACTEC™ MGIT™.
A pesar de ser medios selectivos para las micobacterias, pueden crecer otros microorganismos y es necesario confirmar que el crecimiento obtenido corresponde efectivamente con una especie del CMTB, para lo cual pueden emplearse distintas técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el espoligotipado o la secuenciación genética.
El cultivo microbiológico es una técnica con una alta especificidad diagnóstica, es decir, presenta una probabilidad muy elevada de identificar correctamente un caso negativo.
Sin embargo, esta técnica presenta una sensibilidad diagnóstica (probabilidad de confirmar una infección) moderada, ya que depende en gran medida de:
- La fase de infección.
- La carga bacteriana de la muestra.
- Las muestras tomadas del animal.
- La conservación de las muestras.
Por otra parte, las micobacterias del CMTB se caracterizan por ser de crecimiento lento, por lo que requieren elevados tiempos de incubación que pueden extenderse varias semanas e incluso meses.
Por esta razón existe un gran interés en desarrollar e implementar metodologías más sensibles y rápidas para la confirmación de las infecciones por especies del CMTB, como puede ser la PCR directa en tejido.
TÉCNICAS BASADAS EN LA PCR
Las técnicas basadas en la PCR, principalmente la PCR a Tiempo Real, son técnicas muy sensibles, específicas y rápidas que se han convertido en una alternativa muy interesante para la detección de numerosos patógenos, incluyendo a las bacterias que producen la tuberculosis en tejidos animales, alimentos y muestras ambientales.
La PCR se fundamenta en la amplificación de un fragmento del material genético.
En el caso de las PCR a Tiempo Real, el uso de fluoróforos permite la visualización de la cantidad de ADN amplificado tras cada paso de la reacción (en tiempo real) mediante la detección de fluorescencia.
EXTRACCIÓN DE ADN
Para detectar el ADN del CMTB en el tejido, se parte del mismo homogeneizado que se prepara para el cultivo microbiológico y se realiza un protocolo de extracción de ADN.
La extracción de este ADN es un paso crucial, pues determinará en gran medida la efectividad de la PCR a Tiempo Real y puede verse afectada por distintos factores, como la cantidad de tejido procesado, la rotura adecuada de las estructuras celulares o la presencia de inhibidores de la PCR.
DETECCIÓN DEL GEN DIANA
La diana genética que se selecciona para la PCR es muy importante porque de ella depende la especificidad y sensibilidad de la reacción. Aunque las micobacterias son genéticamente muy similares, existen algunas dianas genéticas específicas del CMTB.
Algunos ejemplos son los genes mpb70, devR y hupB, o las secuencias de inserción IS1081 e IS6110.
En el Centro VISAVET se ha diseñado y puesto a punto una PCR a Tiempo Real directa dirigida a la detección del CMTB mediante la amplificación de un fragmento específico del gen mpb70 (Lorente-Leal et al,. 2019).
La PCR a Tiempo Real directa en tejidos es una herramienta muy útil para el diagnóstico de la tuberculosis bovina.
Las principales conclusiones derivadas del uso de esta metodología son:
1.La concordancia y capacidad diagnóstica son muy similares a la del cultivo, por lo que podría emplearse como un método de diagnóstico alternativo al cultivo microbiológico.
2.El uso de la PCR a Tiempo Real sobre tejidos permite la emisión de resultados en un tiempo reducido de 2-3 días, a diferencia de las 4-12 semanas que requiere el cultivo microbiológico.
3.Al trabajar con ADN se reduce el tiempo de exposición con micobacterias viables, y por lo tanto, disminuye el riesgo de transmisión de la enfermedad al personal cualificado.
4.Las PCRs a Tiempo Real basadas en genes de copia única, como sucede con el gen mpb70, podrían emplearse además en otras áreas donde conocer la cantidad exacta de bacterias es fundamental; como por ejemplo el desarrollo de vacunas o de material diagnóstico de referencia.
Sin embargo, hay que señalar que la extracción directa de ADN a partir de tejidos no es suficiente para su uso en estudios de epidemiología molecular, por lo que el aislamiento del CMTB mediante cultivo sigue siendo necesario.
Tras considerar todas las ventajas de la PCR a Tiempo Real directa en tejido, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación ha incluido esta técnica como una prueba diagnóstica a efectos de investigación dentro del programa actual de erradicación nacional de tuberculosis bovina en España.
El posible uso rutinario de esta metodología puede suponer un avance en la toma de decisiones al agilizar la obtención de resultados con una especificidad y sensibilidad diagnóstica similar al cultivo microbiológico.
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