| Se conoce como serología a las técnicas diagnósticas que permiten evaluar la presencia de anticuerpos (inmunoglobulinas) como respuesta inmunológica humoral a un agente infeccioso.
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FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS SEROLÓGICAS
Las técnicas serológicas son técnicas inmunológicas basadas en la unión irreversible entre una sustancia antigénica (Ag) como virus, bacteria o parásito y su correspondiente anticuerpo (Ac) (Figura 1).
 La formación de los complejos Ag-Ac se evalúa mediante marcadores (enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes, etc.) o por observación de la aglutinación que se produce tras la unión Ag-Ac. |
TÉCNICAS SEROLÓGICAS
Las principales técnicas inmunológicas utilizadas en el diagnóstico serológico de procesos infecciosos en rumiantes son las siguientes:
Inmunoensayo en fase sólida (ELISA)
En este tipo de técnica el Ag se encuentra unido a una fase sólida (placas de 96 pocillos) y la unión Ag-Ac se evidencia enzimáticamente (Figura 2).
La actividad de la enzima sobre el sustrato apropiado se mide mediante cromatografía, siendo la técnica ELISA una de las más utilizadas y de las que hay más kits comerciales disponibles.
Inmunofluorescencia
Los marcadores son sustancias fluorescentes capaces de emitir luz.
Se comercializan láminas con antígenos de los agentes a analizar. Al añadir el suero, los Ac presentes se unen al Ag en la lámina y, posteriormente, se añade Ac antiinmunoglobulina de rumiantes marcado con fluorescencia (conjugado).
El conjugado fluorescente se une a los Ac que previamente se habían unido a los Ag de la lámina, pudiendo visualizar esta unión mediante un microscopio de fluorescencia (Figura 3).
En el diagnóstico rutinario de animales de producción, son técnicas menos utilizadas debido a que son muy laboriosas, dificultando la automatización.
Aglutinación
La unión Ag-Ac produce una aglutinación que es visible macroscópica o microscópicamente.
Macroaglutinación
El ejemplo más conocido es la técnica de Rosa de Bengala para la detección de anticuerpos frente Brucella sp. (Figura 4).
Esta técnica es rápida y económica, por lo que se usa como técnica de screening. Sin embargo, es necesario confirmar los resultados positivos debido a la reacción cruzada con otras bacterias (Yersinia enterocolitica o algunos serovares de Escherichia coli).
Así mismo, puede dar falsos negativos para especies en fase rugosa como Brucella ovis.
Microaglutinación
La técnica MAT (por sus siglas en inglés de “Microscopic Agglutination Test”) requiere la utilización de un microscopio para evaluar la aglutinación producida por la unión Ag-Ac.
La serología de Leptospira sp. se realiza mediante MAT y es específica de cada serovariedad (Figura 5).
Inmunodifusión
Se utiliza como soporte de la prueba un gel de agarosa o gel noble donde se realiza un orificio central y seis orificios externos.
En el orificio central se inocula Ag soluble y en los periféricos se inoculan los sueros a analizar alternados con sueros positivos (controles positivos, Cp). La unión Ag-Ac produce una precipitación que se visualiza como una línea entre el pocillo de Ag y el pocillo de suero.
La inmunodifusión se ha utilizado para el diagnóstico de Maedi-Visna o Brucella ovis, entre otras; sin embargo, tiende a ser sustituida por técnicas menos manuales como las técnicas de ELISA.
TÉCNICAS DE INMUNOENSAYO EN FASE SÓLIDA (ELISA)
Nos detendremos en profundizar en las técnicas de ELISA, ya que son las más utilizadas actualmente. Los diseños de los ensayos son diversos, siendo común en todos ellos la utilización de enzimas como marcadores (Figura 7).
ELISA de bloqueo
Los pocillos de la placa están tapizados con el Ag.
- Al agregar la muestra de suero a analizar, los Ac presentes se unen al Ag.
- En una segunda fase, se añade un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente (conjugado) que se unirá a las moléculas de Ag que queden libres.
- Por último, se incorpora un sustrato que será modificado por la enzima del conjugado observándose un cambio de color.
| Este cambio de color se mide con un espectrofotómetro. La intensidad del color del pocillo es inversamente proporcional a la cantidad de Ac en el suero a estudiar. |
ELISA de competición
Es muy parecido al de bloqueo. La diferencia es que se añade simultáneamente el suero a analizar y el conjugado de anticuerpos marcados enzimáticamente.
Los Ac presentes en el suero compiten con el conjugado por unirse al Ag adherido a la fase sólida.
ELISA indirecto
La unión del Ag con los Ac presentes en el suero se evidencia con la adición de un conjugado específico frente a inmunoglobulinas de rumiantes, por lo que se une a los Ac del suero que se habían unido a los Ag en el primer paso.
La intensidad del color es proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.
CARACTERÍSTICAS DE LA SEROLOGÍA
A la hora de seleccionar una técnica de ELISA y valorar los resultados obtenidos, deberemos tener muy claras una serie de premisas:
Estado de vacunación de los animales
La mayoría de las técnicas serológicas no diferencian entre anticuerpos vacunales y anticuerpos producidos en respuesta a una infección, dificultando la interpretación de resultados en caso de animales vacunados.
Existen en el mercado algunos ensayos DIVA que permiten esta diferenciación.
Este es el caso del diagnóstico de IBR (Rinotraqueitis infecciosa bovina), donde la cepa vacunal de las vacunas marcadas tiene deleccionada la proteína gE, proteína frente a la cual vamos a detectar anticuerpos con los ELISA DIVA.
Objetivo del análisis
Los ELISA indirectos están diseñados para evaluar prevalencias de enfermedades a nivel de población, siendo útiles en el seguimiento y monitorización de rebaños positivos. Sin embargo, no son los más adecuados para el diagnóstico de animales individuales por una mayor probabilidad de falsos positivos.
Los ELISA de bloqueo y de competición son más específicos y son los más indicados para la realización de diagnósticos individuales, siendo habitual su uso para confirmar resultados de otras técnicas usadas como screening (ELISAS indirectos, aglutinación etc.).
Momento de la infección
La presencia de anticuerpos en suero indica que el animal ha tenido contacto con el patógeno.
No suele discriminar entre un proceso agudo o una exposición lejana en el tiempo, lo que dificulta correlacionar un resultado serológico positivo con la etiología del proceso que cursan los animales.
Esta dificultad se puede superar con diferentes estrategias diagnósticas:
| Repetir el estudio serológico
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| Analizar animales de diferentes edades
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| Tipo de Ac detectado
1. IgM positivo + IgG negativo: proceso agudo |
EJEMPLO PRÁCTICO: DIAGNÓSTICO DE ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS (PI) DE BVD
La búsqueda de animales persistentemente infectados (PI) de BVD (Diarrea Viral bovina) se basa en el uso de técnicas serológicas.
- Los animales PI aparecen en el rebaño cuando una vaca gestante contrae la infección por primera vez durante los días 40 a 120 de gestación.
- El virus se introduce en el feto y, como éste todavía no tiene el sistema inmunitario desarrollado, presentará una inmunotolerancia al virus de por vida.
- Por tanto, es un animal que no genera anticuerpos frente al virus y tiene una viremia constante.
La combinación de técnicas directas (detección de Ag) e indirectas (detección de Ac) permiten confirmar que estamos ante un animal PI.
Para el diagnóstico laboratorial es necesario suero sanguíneo y sangre entera. En caso de animales jóvenes la muestra idónea es el cartílago auricular para la detección de Ag.
Cuando el resultado del laboratorio es Ac negativo y Ag positivo, es posible que estemos ante un PI o que sea un animal infectado de manera transitoria.
Por ello, es importante volver a tomar muestras del animal para realizar un segundo ensayo 2-3 semanas después:
Si el resultado es el mismo (Ac negativo y Ag positivo) el animal es un PI y lo recomendable es eliminarlo del rebaño para evitar que sea un foco de contagio para el resto.
En caso de obtener un resultado Ac positivo y Ag positivo/negativo el animal presenta una infección de BVD activa, ya que presenta seroconversión.
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